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郵編：100073
01
研究背景
作者研究中的片段雙抗是一種串聯的單鏈可變片段 (scFv) ，它包含了兩個scFv區域的融合，并由一個短肽Linker連接。由于不含Fc區，因此不能用傳統的單抗純化的方法。接下來看看作者是怎么做的吧！
圖1：片段雙抗結構示意圖
02
捕獲：Protein L親和層析
作者在捕獲階段采用Protein L親和層析，其配基能夠特異性的和抗體輕鏈相互作用結合。首先，將靶向CD19和CD3的片段雙抗在CHO K1細胞成功表達后，離心取上清 (CCS) 。接下來，用含50 mM HEPES，120 mM NaCl，pH 7.4緩沖液平衡層析柱，將細胞上清以10 mg單體/mL填料的量進行上樣。為了獲得最佳的HCP去除效果和目的物的收率，使用ÄKTA avant內置的DoE功能對洗雜緩沖液中不同鹽濃度和pH條件進行篩選，最終選取了513 mM Arg·HCl，87 mM NaCl，pH 6.7的緩沖液。此外，再用含有50 mM HEPES，pH 7.4緩沖液沖洗 5個CV ，以降低電導值。為了提高雙抗單體與高分子量組分 (HMW) 的分離效果，作者在洗脫緩沖液中加入鹽添加劑，通過兩步洗脫：
第一步：洗脫中使用含100 mM Arg·HCl且pH 3.0乙酸緩沖液洗下主要為雙抗單體組分（洗脫峰1，見下圖a），并通過HPLC-SEC進行純度鑒定（見下圖b）；
第二步：洗脫中用不含鹽添加劑的pH 3.0乙酸緩沖液洗下主要為HMW（洗脫峰2，見下圖a）。
通過以上方法獲得的洗脫液回收率為81.3%，HCP減少約3000倍，HMW從細胞培養上清液中的66.5%減少到7.1%。
圖2：ÄKTA avant層析圖譜，(a) Protein L親和層析的兩步洗脫；(b) 通過HPLC-SEC進行純度鑒定
03
精純：Capto adhere多模式層析
對于抗體藥而言，僅一步親和層析純化是遠不夠的，使用多模式復合填料Capto Adhere能進一步去除內毒素、DNA、聚集體和HCP等。在繼親和層析對片段雙抗特異性捕獲之后，采用Capto adhere多模式層析的結合洗脫模式進行精純。用50 mM MES、pH 6.0 緩沖液平衡層析柱，將上一步純化得到的洗脫液調節至pH 6.0，稀釋3倍至電導率6-7 mS/cm，然后上柱。在50 mM MES、300 mM、350 mM、400 mM NaCl，pH 6.0緩沖液中依次洗脫。最終在保障回收率的前提下，去除大量的殘留聚集體，將片段雙抗的單體純度從92.3%提高到98.8%，滿足工業生產需求。
圖3：(a) 通過HPLC-SEC進行純度鑒定；(b) SDS-PAGE的純度鑒定
總 結
雙抗獨特的雙靶點結合能力賦予了新的診療策略。而其表達情況和結構類型紛繁復雜，給下游純化工藝帶來了一定的挑戰。通過ÄKTA avant內置的DoE方法可以大大提高實驗條件篩選的效率，從而更加快速地找到最佳工藝條件。本文的兩步純化工藝（Protein L親和層析+Capto adhere多模式層析），可將HMW和HCP分別降低至<1%和<100 ppm，總收率可達65%，純度可達98.8%，證明了兩步法純化片段抗體的潛力。