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動物細(xì)胞來源外泌體生產(chǎn)中的細(xì)胞培養(yǎng)工藝

日期：2022-10-10 15:29:48??? 點擊：

細(xì)胞外囊泡，尤其是其中的外泌體，正在迅速成為一種新型診斷和治療工具。外泌體是細(xì)胞分泌至胞外的納米囊泡，直徑50–150 nm，通過在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸 (RNA)、siRNA、脫氧核糖核酸 (DNA) 和蛋白質(zhì)等內(nèi)源性物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用。外泌體除了直接作為診斷和治療工具外，也可以作為天然衍生的納米遞送系統(tǒng)，遞送外源性小分子、腺相關(guān)病毒、siRNA、miRNA 和蛋白質(zhì)等。與傳統(tǒng)的合成脂質(zhì)體相比，外泌體具有低免疫原性、低毒性及長半衰期等優(yōu)勢。

目前外泌體生產(chǎn)工藝普遍產(chǎn)量低、回收率或純度低、靶向特異性差，使得外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)仍是阻礙其發(fā)展的主要瓶頸之一。外泌體生產(chǎn)包括上游細(xì)胞培養(yǎng)工藝，下游分離純化工藝，以及目標(biāo)產(chǎn)品屬性定義及詳細(xì)表征等幾大構(gòu)成部分。

本文將為大家介紹動物細(xì)胞來源外泌體生產(chǎn)中的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和工藝。

外泌體可來源于幾乎所有細(xì)胞，目前可通過GMP生產(chǎn)獲得治療性外泌體的主要有五類細(xì)胞，包括人心臟祖細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)、脂肪組織來源的干細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞 (DCs) 和 HEK293 細(xì)胞等。外泌體是細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，因此其生產(chǎn)取決于以不改變細(xì)胞表型的方式生產(chǎn)大量細(xì)胞的能力。外泌體上游生產(chǎn)中，需依據(jù)細(xì)胞的特性選擇不同的細(xì)胞培養(yǎng)工藝。

外泌體生產(chǎn)的主要細(xì)胞培養(yǎng)模式

一、小規(guī)模靜態(tài)培養(yǎng)

產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞在T型細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等平面容器中靜態(tài)培養(yǎng)，適合貼壁生長的細(xì)胞。上述五種常用于外泌體生產(chǎn)的細(xì)胞中除經(jīng)過懸浮馴化的HEK293細(xì)胞外，都可采用靜態(tài)培養(yǎng)，優(yōu)點是工藝簡單、易于建立，適合實驗室水平早期研究開發(fā)。

二、放大培養(yǎng)

對于貼壁依賴細(xì)胞，擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模主要通過擴(kuò)大表面積。通過T-Flask、滾瓶、細(xì)胞工廠等進(jìn)行的2D貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)模相對有限，較難進(jìn)行工藝放大。使用中空纖維生物反應(yīng)器；或在Spinner或攪拌罐生物反應(yīng)器（SR）中進(jìn)行貼壁依賴細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，可以克服單層貼壁細(xì)胞生產(chǎn)外泌體中表面積有限這一最大難題，通過在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量細(xì)胞和外泌體來提高效率。

中空纖維生物反應(yīng)器

優(yōu)勢和特點：

中空纖維生物反應(yīng)器由半透毛細(xì)纖維和圓柱構(gòu)成，外泌體生產(chǎn)中細(xì)胞可位于纖維內(nèi)部，培養(yǎng)基通過擴(kuò)散到達(dá)細(xì)胞，排出細(xì)胞代謝物。與動態(tài)生物反應(yīng)器系統(tǒng)不同，中空纖維生物反應(yīng)器可以提供與平面 T 型培養(yǎng)瓶等類似的培養(yǎng)模式。而且通過設(shè)計和優(yōu)化，可以利用灌流方式將外泌體產(chǎn)物保留在培養(yǎng)室中，獲得更濃縮的條件培養(yǎng)基，進(jìn)而降低下游的液體處理負(fù)擔(dān)。目前貼壁HEK293細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSC)，均已實現(xiàn)GMP 條件下在中空纖維生物反應(yīng)器中生長，并分離出外泌體。

挑戰(zhàn)及影響因素：

中空纖維生物反應(yīng)器可以維持細(xì)胞生長，但在培養(yǎng)參數(shù)的放大和可控性方面仍具有很大挑戰(zhàn)。外泌體的收獲窗口具有時間限制，細(xì)胞在高密度下會發(fā)生接觸抑制及相關(guān)的行為變化。有研究發(fā)現(xiàn)，以高密度 (90%) 接種的小鼠脂肪 MSC，在 48 小時內(nèi)出現(xiàn)與細(xì)胞間接觸抑制相關(guān)的各種基因的表達(dá)改變；而細(xì)胞過度融合之前收獲外泌體，則能夠更好地保持各項產(chǎn)品參數(shù)。

攪拌式生物反應(yīng)器 (SR)

搖瓶、Spinner、轉(zhuǎn)瓶或生物反應(yīng)器等都可作為動態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行外泌體生產(chǎn)。動態(tài)培養(yǎng)可達(dá)到的細(xì)胞密度因不同的操作模式和培養(yǎng)類型而有所不同，SR主要用于中試和大規(guī)模生產(chǎn)，優(yōu)點是易于放大、培養(yǎng)環(huán)境同質(zhì)穩(wěn)定、培養(yǎng)參數(shù)可控，可在線監(jiān)測。依據(jù)細(xì)胞的特性，可進(jìn)行全懸浮SR培養(yǎng)和微載體SR培養(yǎng)。

a. 懸浮適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)

SR生物反應(yīng)器尤其適合懸浮適應(yīng)細(xì)胞的外泌體生產(chǎn)。Margaret Liu等使用無動物來源化學(xué)成分明確細(xì)胞培養(yǎng)基，采用流加批次方式，成功在 0.5-5L SR 中建立了懸浮適應(yīng) HEK293 細(xì)胞外泌體生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝，同時研究了細(xì)胞培養(yǎng)工藝中的主要影響因素：

i. 抗結(jié)團(tuán)劑，與其他懸浮適應(yīng)的細(xì)胞系相比，HEK293細(xì)胞具有明顯的結(jié)團(tuán)傾向，通過使用抗結(jié)團(tuán)劑糾正細(xì)胞的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，可使細(xì)胞生長得到明顯改善，VCD 從2.7 增至3.6 × 106 cells mL−1，單細(xì)胞外泌體產(chǎn)量從0.46 增至2.7 × 10e6 particles/cell，單位體積產(chǎn)量因此提高了8倍。

ii. 補(bǔ)料策略，與單純補(bǔ)糖和GlutaMAX的批次培養(yǎng)相比，額外補(bǔ)充 3.5 g/ L的HyClone Cell Boost 補(bǔ)料可將VCD從 3.60增至6.31 × 10e6 cells mL−1，外泌體產(chǎn)量則由7.6 × 10e12 增加至54.7 × 10e12 /L。

iii. 收獲時機(jī)，當(dāng)收獲時細(xì)胞活率從94%分別降至 76% 和48%時，包括外泌體在內(nèi)的整體細(xì)胞外囊泡產(chǎn)量分別由37.0 × 10e12增加至 50.9 he56.5 × 10e12 particles/L，但同時也導(dǎo)致外泌體純度和生物功能下降，因此該工藝采用了80-90%的較高收獲時細(xì)胞活率。

b. 貼壁細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)

人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC ）是常用的外泌體產(chǎn)生細(xì)胞，具有貼壁依賴性。在SR中使用微載體懸浮培養(yǎng)，可明顯增加hMSV等貼壁依賴細(xì)胞的培養(yǎng)效率及外泌體產(chǎn)量。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，生物反應(yīng)器可提供更好的過程控制，但在控制反應(yīng)器內(nèi)環(huán)境參數(shù)的同時，保持細(xì)胞和衍生外泌體的表型不發(fā)生改變方面也存在很大挑戰(zhàn)。當(dāng)細(xì)胞從靜態(tài)、平面培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到動態(tài)、需持續(xù)混合的 3D 環(huán)境時，攪拌和通氣引起的剪切應(yīng)力存在導(dǎo)致細(xì)胞水平及其分泌的外泌體表型改變的風(fēng)險。有報道稱，在轉(zhuǎn)速為180 rpm生物反應(yīng)器中培養(yǎng)T 細(xì)胞，會引起其白細(xì)胞介素 2 受體快速下調(diào)，細(xì)胞擴(kuò)增減少。剪切應(yīng)力可通過誘導(dǎo)MSCs的 p38 絲裂原活化蛋白激酶，和細(xì)胞外信號相關(guān)激酶的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致其成骨分化，進(jìn)而改變其外泌體表型。此外，限制高剪切動態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)胞死亡以最大限度地減少來自凋亡囊泡的雜質(zhì)至關(guān)重要。因為凋亡囊泡的與外泌體大小重疊，可能會增加異質(zhì)性并降低外泌體產(chǎn)物的效力。

外泌體生產(chǎn)中的細(xì)胞培養(yǎng)基

一、含血清培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加血清是貼壁依賴細(xì)胞培養(yǎng)最經(jīng)典的培養(yǎng)方式，適合各種貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，可以最大限度保持細(xì)胞及其分泌的外泌體的天然表型。含血清培養(yǎng)用于外泌體生產(chǎn)最大的問題是血清本身含有外泌體，可以通過對血清進(jìn)行外泌體去除處理減少污染。

二、無血清培養(yǎng)

除了血清自身的外泌體，從含血清培養(yǎng)基中分離出的外泌體會含有一些源自血清的雜質(zhì)，可能會進(jìn)入最終藥物產(chǎn)品，從安全性和監(jiān)管的角度來看是不利的。無血清培養(yǎng)可以很好的解決這些問題，但需要注意的是，無血清培養(yǎng)條件本身對適應(yīng)含血清培養(yǎng)的細(xì)胞就是一種應(yīng)激，有可能導(dǎo)致細(xì)胞的外泌體發(fā)生變化，及凋亡小體增加。有研究發(fā)現(xiàn)，相較含血清培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生的外泌體數(shù)量更多，大小或生化性質(zhì)上沒有差異。但蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，無血清培養(yǎng)獲得的外泌體含有更多的活性氧和應(yīng)激相關(guān)蛋白。此外也有報道稱源自含血清培養(yǎng)基的外泌體RNA 加工蛋白含量更高。因此無血清培養(yǎng)的前提是維持細(xì)胞特征和外泌體產(chǎn)品屬性。需要對無血清應(yīng)激下產(chǎn)生的外泌體的組成、治療性能和安全性進(jìn)行徹底研究，排除無血清培養(yǎng)應(yīng)激引起的外泌體表型改變。