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轉化醫學之層析如何助力腫瘤免疫？這3篇文獻值得一看
日期：2022-10-10 15:24:43???
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免疫治療是二十一世紀醫學的一項重大突破，近年來腫瘤免疫治療發展空前。
圖3. Cas12a蛋白的層析方法及基因編輯系統制備CAR-T細胞的研究思路
腫瘤免疫在單抗、雙抗、ADC藥物、免疫檢查點抑制劑等藥物開發，以及CAR-T、TCR-T等基因治療中的相關研究層出不窮。在研臨床研究數量超過上千個，數量還在不斷增加中。
下面我們就來看一下在藥物開發以及免疫療法的過程中，層析又會發揮什么樣的關鍵作用？
黑色素瘤&免疫檢查點抑制劑
在過去的十年中，免疫療法極大地改變了腫瘤治療的格局。目前，免疫檢查點抑制劑（ICIs）已經成為免疫腫瘤學研究中最熱門的領域之一。免疫檢查點抑制劑就是針對特定的免疫檢查點研發的一些藥物，來阻斷表達免疫檢查點的腫瘤細胞與免疫細胞之間的作用。目前展開研究的檢查點通路靶點包括：CTLA-4、PD-1、LAG-3、KIR和OX40等。
2021年1月25日，FDA正式授予特瑞普利單抗(Toripalimab)快速通道資格，用于黏膜黑色素瘤的一線治療。特瑞普利單抗是一款中國自主研發的針對T細胞表面PD-1的人源化IgG4的單抗，已經獲批在中國市場銷售，并在醫保談判中被納入醫保范圍。
在中科院微生物所聯合上海君實這項研究[1]里，首先重組表達帶有6xHis標簽的PD-1，收集上清液后在HisTrap HP鎳離子親和層析柱上粗純，第二步用Superdex 200 10/300 GL分子篩層析柱進一步精純得到了PD-1重組蛋白。隨后將特瑞普利單抗酶解消化獲得其Fab抗體片段，用HiTrap Protein A FF親和填料做Fab片段的捕獲，除去酶解過程中產生的雜質。
接下來把純化后的重組PD-1蛋白和特瑞普利單抗Fab片段以1：1混合，冰上孵育30分鐘并用Superdex 200 10/300 GL進一步純化。得到的復合物蛋白晶體收集衍射數據，進行相互作用機制的分析后發現：特瑞普利單抗的HCDR3區域主要與PD-1的FG環結構結合，具有多種氫鍵相互作用，可以阻斷 PD-1 與PD-L1，PD-L2之間的相互作用，作為免疫檢查點抑制劑發揮抗腫瘤功能。
類似以上需要純化蛋白樣品來做結晶或冷凍電鏡的實驗，制備量通常較少，但純度與回收率要求達到很高，更加適合使用微量純化設備ÄKTA pure micro來完成層析步驟，減少稀釋效應，提高分辨率。
圖1. PD-1及特瑞普利單抗復合物的層析方法及機制解析結果
胃癌&雙抗
疾病往往是復雜的，尤其是對于腫瘤疾病。而雙抗往往有更精確的靶向性和更好的效果。胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發病率在世界癌癥發病率中位居第四位，死亡率居第二位，近二十年來亞洲地區胃癌發病率和死亡率呈現了逐年上升趨勢。LewisY抗原是一種在大多數上皮癌（包括胃癌、卵巢癌等）中高度表達的聚糖，在多項臨床試驗中，LewisY已被評估認為是治療上皮癌的有效靶點。
上海交通大學藥學院聯合杰科生物于2021年發表了一篇研究文章[2]，構建了以IgG-[L]-scfv格式的靶向LewisY和CD3雙抗(m3s193)。構建好的雙抗在哺乳動物細胞系HEK293F中表達良好。經過一步MabSelect SuRe親和層析純化后，雙抗的產品純度可達到95%以上，滿足體外和體內測定。另外值得一提的是，MabSelect SuRe這款填料可以高效捕獲抗體，且耐堿，可以反復使用。
隨后的體外結果顯示制備得到的這種雙抗能激活CD8+T和CD4+T細胞，促進更多的T細胞浸潤到腫瘤微環境中，顯著抑制胃癌腫瘤的生長。同時表現出比親本單抗更好的治療效果，也為胃癌的治療提供了更多基礎研究。
圖2. 靶向LewisY和CD3雙抗(m3s193)的層析方法及活性驗證
利用CRISPR/ Cas12a生成CAR-T細胞
腫瘤免疫相關的治療藥物除了以上兩個案例提到的抗體或融合蛋白，嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法的出現也同樣掀起了免疫治療的熱潮。目前臨床多采用病毒的方式將CAR基因導入T細胞中，基于隨機整合的原理使得基因整合至T細胞基因組中，這種方法一定程度上存在轉錄沉默、細胞癌變、異常增殖等風險。而利用基因編輯技術聯合同源重組將CAR基因定點整合至T細胞特定基因座中則提供了一種更為安全的CAR-T細胞制備方法。
北京大學最近的一些相關研究[3-4]就正在嘗試使用基因編輯技術，在精確的基因組位點中創建CAR-T細胞。將Cas12a蛋白在2YT培養基中表達，并用鎳親和柱與高分辨率的Superdex 200 Increase 10/300 GL分子篩層析柱兩步純化。隨后將純化的Cas12a蛋白利用基因密碼子擴展技術共價偶連crRNA，形成Cas12a-crRNA共價復合物。用電轉的方式將Cas12a-crRNA共價復合物導入原代T細胞中，對內源性TRAC基因進行了定點敲除，隨后通過AAV將CAR基因導入T細胞中，促使CAR基因定點重組至TRAC基因座中，通過這種方法提供了一種高效制備定點整合CAR-T細胞的策略，且所制備的 CAR-T細胞具有良好的抗腫瘤效應，為Cas12a的廣泛運用及臨床研究奠定了基礎。
圖3. Cas12a蛋白的層析方法及基因編輯系統制備CAR-T細胞的研究思路
總結
在腫瘤相關藥物開發以及免疫療法的過程中，可見層析發揮了非常關鍵的作用。以上是層析在腫瘤免疫學中的一些應用案例分享。目前在該領域常用到的層析柱或填料包括分子篩的Superdex系列和Superose系列；標簽蛋白親和層析填料如His標簽，Strep標簽等親和柱系列；抗體和抗體片段純化常用的Mabselect PrismA系列。此外，精細純化階段陰、陽離子交換填料如Capto HiRes Q和Capto HiRes S系列等也經常使用。
Cytiva作為層析領域的先行者，可以提供從層析填料，到層析設備，以及層析方案等一系列產品與解決方案。
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